GENSKA TERAPIJA

Danijela Bataveljić

Dragana Dobrijević

Dragana Popović

Dragana Tomašević

Jelena Grahovac

Ksenija Nedeljković

Lana Ostojić

Lela Stojanović

Maja Bundalo

Marko Marković

Mihailo Jelić

Mihajlo Bošnjak

Milan Popović

Miloš Cvetković

Sanja Laković

Vlado Antonić

Avalić Nevena

Milačić Iva

Svetlana Dodić

 

III grupa

    

Genska terapija predstavlja nov pristup u lečenju ili prevenciji različitih bolesti   uvodjenjem  ,,divljeg’’  ( wild type) tipa gena u ćelije zahvaćene mutacijom. Genska terapija je još uvek u početnoj fazi razvoja  i može  se smatrati eksperimentalnom, sa velikim brojem kliničkih proba. Očekuje se da nakon uspešne izolacije gena  u kojima su ispoljeni monogenetski poremećaji genska terapija po prvi put pruži lek za genetičke bolesti, a uvođenje DNK i oligonukleotida u ćelije bi trebalo da doprinesu lečenju nenaslednih bolesti, kao što je kancer. U tekstu koji sledi pokušaću da opišem oblike, primenu  i prepreke na koje istraživači nailaze pokušavajući da nađu odgovarajući lek za različite bolesti.

 

OBLICI GENSKE TERAPIJE

 

1. Somatična genska terapija – genetski defekt se ispravlja samo u somatičnim (telesnim) ćelijama pacijenta koji je zaražen određenom bolešću, a genetička promena je ograničena samo na životni vek lečene osobe.

2. ,,Germline’’ genska terapija – genetski se modifikuje gamet (reproduktivna  ćelija – oplođena jajna ćelija ili embrion) i to pre nego što se  serija germinativnih ćelija odvoji od ćelija koje će da izgrade ostali deo tela, ovako načinjene promene se prenose na sledeće generacije. Ovakav vid terapije je nov i potrebno je ispitati njene posledice pre bilo kakvih pokušaja, pa je zbog toga i zabranjena u većini zemalja. Ipak, 2001. godine naučnici su potvrdili rođenje 30 ,,genetski modifikovanih beba’’, čije su majke bile podvrgnute proceduri koja je nazvana 

 

4. Ex vivo genska terapija – vrši se uvođenjem transgena u izolovane ćelije, da bi se njima moglo manipulisati  in vitro. Zatim se vrši selekcija onih ćelija koje su primile transgen, pa se ovi ćelijski klonovi ponovo uvode u telo pacijenta. Ovaj oblik terapije je pogodan za genetičke defekte koji se odnose na krvne ćelije. Korišćen je u lečenju dificijencije adenozin deaminaze (ADA) i to je jedina genska terapija koja je do sada dala rezultate kliničkog poboljšanja.

5. In vivo genska terapija – transgen se direktno uvodi u ćelije napadnute zarazom.Na ovaj način moguće je lečiti cističnu fibrozu ili mišićnu ditrofiju. Tako bi DMD bila tretirana uvođenjem distrofin gena u mišićne ćelije, a CF uvođenjem CFTR gena u ćelije vazdušnog protoka. Kod obe bolesti su to ćelije čija poremećena funkcija izaziva glavne efekte koji su opasni po život, međutim nisu jedine. Pacijenti cistične fibroze mogu da pate od pankreasnog nedostatka, defekta u vas deferensu, problema jetre, dok pacijenti mišićne distrofije imaju problema sa srcem ili defekte CNS-a. Kada bi i ovi defekti bili uspešno otklonjeni ne znači da bi bolest u potpunosti bila izlečena .

6. Adicija ili zamena gena – defektni gen se u potpunosti  zamenjuje funkcionalnim transgenom, što bi obezbedilo terapiju za sve tipove mutacija. Zamena bi uključivala homologu rekombinaciju između transgena i hromozomalne kopije, što je moguće, jer se genetičari oslanjaju na ovakvu rekombinaciju. Zamena gena zahteva procedure u kojima se bira mali broj ćelija kojima je promena potrebna.,,Germline’’terapija zahteva  precizne zamene gena , jer je to jedini siguran način da se obezbedi kompletno normalna ekspresija gena. Smatra se da je zato ova terapija još uvek nemoguća, što svakako dovodi u pitanje gore navedene podatke o rođenju ,,prvih genetski modifikovanih beba’’.Iščitavajući dostupnu literaturu u želji da saznam više o ovoj temi, zaključila sam  da su se uglavnom vodile rasprave o tome da li je to moguće ili ne , da li je etički i slično, ali na žalost nisam pronašla čvrste dokaze koji bi me ubedili da je ovaj tip genske terapije uspešano primenjen, iako je sama procedura opisana i  teoretski  svakako moguća.

7. Animalni modeli – pošto genske terapije zahtevaju niz eksperimenata , ne mogu se svi izvoditi na ljudima, pa su animalni modeli korisni za demonstraciju principa i razvoja tehnologije.Transgeni  miševi pate od sličnih simptoma kao i ljudi,pa mogu da budu korišćeni u cilju razvoja genske terapije.

 

PRENOSIOCI ZA GENSKU TERAPIJU BAZIRANI NA VIRUSIMA

 

TRANSFER GENA RETROVIRUSIMA

 

          Retrovirusi imaju dva identična RNK genoma . Po završetku infekcije, RNK se kopira  u DNK viralno, enkodiranom reverznom transkriptazom. DNK se integriše u genom domaćina u procesu koji zavisi od LTR-dugih terminalnih ponovaka, na svakom kraju genoma. Rezultujući RNK molekuli su spakovani u partikule virusa, a proces pakovanja zahteva sekvencu označenu kao P. Retrovirusi mogu da budu onkogenetski ako se integrišu uzvodno od ćelijskog onkogena, pa produkt ovakve terapije ne sme da bude kontaminiran sa virusima za replikaciju. Ovo je postignuto korišćenjem spakovane ćelijske linije u kojoj su esecijalni retroviralni geni podeljeni između dva različita DNK molekula, od kojih ni jedan nema P sekvencu neophodnu za inkorporaciju u virion. Treći molekul DNK nosi gen koji bi trebalo da bude prenešen zajedno sa P sekvencom, spojenom između LTRs. Ovako spakovana ćelijska linija proizvodi retrovirusne partikule koje sadrže željeni gen ,koji može da inficira target ćeliju. Kada se jednom nađe u ćeliji, pol protein iz virusne partikule, osigurava da gen bude integrisan u genom domaćina.

        Prednost transfera gena retrovirusima  je pre svega u efikasnosti i stabilnosti uvedenog gena. Koristi se za ex vivo terapiju zasnovanu na replikaciji ćelija. Mnoge probe genske terapije napreduju koristeći retroviralne vektore za transfer gena. Prvo uspešno korišćenje  ovog vida terapije bilo je u lečenju SCID-a. Jedan od uzroka SCID-a je nasledni nedostatak ADA, koji utiče na limfocite.

 

TRANSFER GENA ADENOVIRUSIMA

 

       Adenovirusi su dvolančani DNK virusi  koji inficiraju nedeljive ćelije respiratornog i gastrointestinalnog trakta i kao takvi predstavljaju privlačne prenosioce za gensku terapiju. Sposobnost adenovirusa da inficiraju neproliferišuće ćelije je rezultirala u pokušajima da se koriste za gensku terapiju za DMD, jer je neophodno tretirati nedeljive ćelije. Adenoviruse je neophodno onesposobiti da bi se sprečila njihova replikacija i ubijanje ćelija domaćina, oni su efikasni u isporučivanju DNK u njihove target ćelije. Međutim, veliki korak unazad je to što su kliničke probe pokazale da i onesposobljene forme uzrokuju jak imuni odgovor. Ovo limitira bezbednu dozu, koja bi trebalo da bude upotrebljena. Inače, ekspresija je prolazna, pa se ponavlja više puta. U skorije vreme  su razvijeni rani geni sa delecijama kako bi smanjili  ekspresiju kasnih gena koji mogu da budu odgovorni za imuni odgovor.  

 

 

 

TRANSFER GENA ADENO-ASOCIRANIM VIRUSIMA

 

         Ovi virusi  (AAV) su po prirodi replikaciono-defektni  i zavise od drugih pomoćnih virusa, koji im daju esencijalne funkcije. Prednosti ovih virusa su u tome što nisu patogeni, pokazuju dugotrajnu ekspresiju itd. Ovi vektori su korišćeni za terapiju cistične fibroze.

 

 

NEVIRALNE METODE GENSKOG  TRANSFERA

 

        Za navedeni tip transfera se koriste:   1.)   lipozomi  - koji  nisu pokazali zadovoljavajuću efikasnost, jer se u sam lipozom može smestiti mali broj plazmida; 2.)  lipopleksi – lako se pripremaju i ne ograničavaju količinu DNK koji mogu da ponesu, ali im je efikasnost manja nego kod transfera zasnovanih na virusima; 3.) gola DNK – korišćena je kao negativna kontrola, pri analizi  lipopleksa i lipozoma, jer nju ćelija ne apsorbuje.

 

 

    PROBLEMI  KOJI SE JAVLJAJU PRI GENSKOJ TERAPIJI

 

        Prvi problem koji se javlja je način prenošenja gena. On se prevazilazi vektorima i to virusima, a alternativa njima je kompleks DNK sa lipidima i proteinima. Istraživači eksperimentišu inseriranjem 47-og hromozoma ( veštačkog ljudskog) u telo. On bi automatski funkcionisao pored standardnih 46 hromozoma – ne utičući na njihov rad i ne izazivajući mutacije. To bi bio ogroman vektor sposoban da brine o genetičkom kodu i da ga odredi, na osnovu konstrukcije, a imuni sistem ga ne bi napadao stvarajući negativan odgovor na opisane viruse.

 

Drugi problem je  razumevanje funkcije gena.Do sada je otkriveno 100.000 gena,ali je funcija ogromnog broja još uvek nepoznata. Pokušavajući gensku terapiju, a ne znajući kako ceo sistem funkcioniše može  da se odredi funkcija gena samo za pojedine bolesti. Na primer, srpasta anemija (Sickle Cell Anemia – SCA) je oboljenje izazvano greškom na genu koji telu govori kako se sintetiše hemoglobin. SCA preovladava među Afroamerikancima. Deca koja naslede dve kopije (od oba roditelja) gena za SCA oboljevaju, a ako naslede jednu ne. Greška koja se javlja postoji već hiljadama godina među ljudima koji žive u Africi, Indiji i na srednjem istoku. Kada se jednom sekvenca ljudskog genoma kompletira, sledeći korak će  biti određivanje funkcije svakog gena ponaosob.

 

        Treći problem su višegenska oboljenja.Većina genetičkih bolesti zahvata više od jednog gena, a na njih utiče i okolina. Proučavanja koja su vršena na identičnim blizancima pokazuju da oni ne boluju od istih bolesti, što govori o uticaju okoline na razvoj individua.

        Uspeh genske terapije na svim poljima bio bi, po mom mišljenju, najveće i najvažnije otkriće ovog veka.Teorijske mogućnosti genske terapije su izvanredne, praktična primena pokazuje rezultate, ali to je svakako nedovoljno da zadovolji naša velika očekivanja, pogotovo nas, koji počinjemo da shvatamo njenu ogromnu vrednost.Genska terapija je budućnost kojoj moramo da težimo, pre svega zbog nas samih i naših potomaka.

 

Tabela 2. Neke uporedne karakteristike virusnih vektora

Vektor

Veličina transgena

Integracija

Transdukciona efikasnost

Glavne prednosti

Glavni nedostaci

MMLV

<8kB

Da

Visoka

Stabilna transfekcija ćelija u deobi

Inficira samo ćelije koje se brzo dele

Adeno

<7.5kB

Ne

Visoka

Transfecira ćelije u deobi i van nje, tropizam ka respiratornom tkivu

Prolazna ekspresija, izaziva imuni odgovor, uobičajen humani virus

AAV

<4kB

Da (?)

Visoka

Stabilna transfekcija

Mala veličina transgena, integracija slabo razumljiva

HSV

<20kB

Ne

Niska

Velika veličina transgena, neurotropan.

Prolazna ekspresija, moguće generisanje infekcije sa HSV

Vaccinia

<25kB

Ne

Visoka

Efikasna infekcija ćelija

Limitirana primena kod vakcinisanih ili imunokompromitovanih individua

MOLEKULARNA BIOLOGIJA I FIZIOLOGIJA